Insight discovery of potential and functions of isolated anaerobic lignocellulolytic fungi and enhanced methane production in anaerobic digestion system

จากวิกฤตการณ์พลังงานรวมถึงความมั่นคงทางด้านพลังงาน ปัญหาทางด้านสิ่งแวดล้อม และปัญหาสุขภาพของมนุษย์ จากการบริโภคใช้พลังงานฟอสซิล การใช้พลังงานสะอาดที่เป็นพลังงานทดแทนจึงเป็นโจทย์วิจัยเร่งด่วนที่นำมาใช้ในการแก้ปัญหาที่เกิดขึ้นในปัจจุบัน การผลิตก๊าซชีวภาพจากชีวมวลจึงเป็นวิธีแก้ปัญหาวิธีหนึ่งที่นิยมใช้ เนื่องจากก๊าซชีวภาพมีการนำมาใช้อย่างแพร่หลาย เป็นที่ยอมรับ ราคาถูก พลังงานทดแทนและสะอาด เป็นพลังงานที่ยั่งยืน ตามแนวคิดของ BCG economy model ที่จะหาพลังงานทางเลือกที่ยั่งยืนและเป็นพลังงานสะอาด ซึ่งก๊าซชีวภาพตอบโจทย์และเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อม ประเทศไทยเป็นประเทศอุตสาหกรรมการเกษตร มีวัสดุเหลือทิ้ง ทั้งในแปลงเกษตรและโรงงานอุตสาหกรรมในแต่ละปีเป็นจำนวนมากถึงปีละ 116 ล้านตัน วัสดุเหลือทิ้งเหล่านี้มีเซลลูโลส 32-45% และ เฮมิเซลลูโลส18-30% เป็นองค์ประกอบที่มีศักยภาพในการผลิตก๊าซชีวภาพ โดยเฉพาะฟางข้าว ที่มี เซลลูโลส 32% เฮมิเซลลูโลส 18% ที่มีศักยภาพในการเป็นวัตถุดิบในการผลิตก๊าซชีวภาพ แต่โครงสร้างผนังเซลล์ฟางข้าว ยังมีลิกนินที่เป็นอุปสรรคในการย่อยสลายเช่นกัน การจะใช้ฟางข้าวมาผลิตก๊าซชีวภาพโดยไม่มีการปรับสภาพ (pretreatment)  จะเป็นการลดต้นทุนแต่จำเป็นต้องมีจุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพในการย่อยสลายชีวมวลที่เป็นลิกโนเซลลูโลส 

กลุ่มจุลินทรีย์ในกระเพาะสัตว์เคี้ยวเอื้องมีคุณสมบัติในการย่อยสลายผนังเซลล์ที่เป็นลิกเซลลูโลสได้ดีจากรายงานคุณสมบัติการย่อยเซลลูโลส ส่วนใหญ่มีรายงานเชื้อแบคทีเรียไม่ใช้ออกซิเจน จากรายการศึกษาประชากรจุลินทรีย์ในกระเพาะสัตว์เคี้ยวเอื้องด้วยวิธี metagenomic shotgun sequencing เพื่อหาอนุกรมวิธานและบทบาทหน้าที่ของประชากรจุลินทรีย์ พบว่า ในกระเพาะสัตว์เหล่านั้น ไม่เพียงแต่มีแบคทีเรียไม่ใช้ออกซิเจนแต่ยังมีเชื้อรา (Anaerobic fungi, AF) โปรตัวซัว และเมทาโนเจน ซึ่งจากการศึกษานี้พบว่า AF ในกระเพาะสัตว์นั้นมีศักยภาพในการย่อยสลายชีวมวลที่เป็นลิกโนเซลลูโลสมากกว่าแบคทีเรียที่ปริมาณเท่ากัน และ AF ยังมีศักยภาพในการช่วยเพิ่มผลผลิตก๊าซชีวภาพ ในการศึกษานี้จะเน้นที่ AF เข้ามามีส่วนร่วมและนำมาใช้ในการผลิตก๊าซชีวภาพจากชีวมวลลิกโนเซลลูโลสที่ใช้ฟางข้าวเป็นแหล่งวัตถุดิบ การคัดแยก AF จะทำได้ยากกว่าแบคทีเรีย รวมถึง AF มีอัตราการเจริญเติบโตที่ช้ากว่าแบคทีเรีย การจำแนกสายพันธุ์ที่ต้องใช้ทั้งหลายตำแหน่งของลำดับนิวคลีโอไทด์ ในการพิจารณา เช่น ITS1, ITS2, LSU และ ตำแหน่ง ITS1-LSU ร่วมกับสัณฐานวิทยา ในขณะที่ แบคทีเรียใช้ 16S ร่วมกับสัณฐานวิทยา  อย่างไรก็ตามข้อมูลการคัดแยกAF บริสุทธิ์ การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ทั้งจีโนม ยังมีน้อยพบข้อมูลเพียง 6 จีโนมและยังถูกใช้เฉพาะในกลุ่มวิจัยที่คัดแยกได้ ซึ่งยังไม่มีรายงานการศึกษาการคัดแยก AF ในประเทศไทย การจะนำ AF จากกระเพาะสัตว์มาใช้ร่วมกับแบคทีเรีย และเมทาโนเจนในระบบบำบัดและผลิตก๊าซชีวภาพจากชีวมวล จีงเป็นเรื่องที่น่าสนใจในการเพิ่มผลผลิตก๊าซมีเทน โดยลดขั้นตอน pretreatment ของวัตถุดิบที่เป็นชีวมวล

          การศึกษานี้มีระยะเวลาในการดำเนินการทดลอง 2 ปี โดยจุดประสงค์ปีที่ 1 เพื่อคัดแยก AF บริสุทธิ์เป็นแหล่งเชื้อในการเพิ่มประสิทธิภาพในการย่อยสลายชีวมวลที่เป็นลิกโนเซลลูโลส จำแนกสายพันธุ์ AF ที่คัดแยกได้ เนื่องจากอัตราการเจริญช้าของ AF และหลากหลายเทคนิคในการจำแนกสายพันธุ์ และปีที่ 2 มีวัตถุประสงค์ ในการวิเคราะห์ข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จีโนมเพื่อเข้าใจถึงศักยภาพและบทบาทหน้าที่ในการย่อยสลายชีวมวลเพื่อผลิตก๊าซชีวภาพให้ได้ประสิทธิภาพสูงสุด ใช้ข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์เพื่อหาวิธีการตรวจสอบประสิทธิภาพและการทำงานของ AF ในระบบ เพื่อคาดการณ์ระยะเวลาในการย่อยและการเพิ่ม AF เข้าไปในระบบ

          แผนการดำเนินงานในปีที่ 1 จะทำการคัดแยกเชื้อ AF บริสุทธิ์จากหัวเชื้อ Anaerobic lignocellulolytic fungal consortium (AFC) ที่มาจากกระเพาะควาย ทำการกำจัดแบคที่เรียในขั้นตอนการเลี้ยงเริ่มต้นด้วยแพนนิซิลินและ สเตปโตมัยซิน เลี้ยงเพิ่มประมาณในฟางข้าว จนมีประมาณมากพอและความเสถียร เชื้อ AFC นี้มีประสิทธิภาพในการย่อยฟางข้าว 86% และเปลี่ยนฟางข้าวเป็นก๊าซชีวภาพ ได้ 336 mL/g ซึ่งพบว่าเป็นประสิทธิที่สูงสุดเมื่อเทียบกับงานวิจัยที่ได้รับการตีพิมพ์ทั่วโลก  AFC ที่เป็นแหล่งเชื้อที่ใช้แยก AF ถูกเลี้ยงในห้องปฏิบัติการมาเป็นเวลากว่า 3 ปี ชอบเจริญร่วมกันกับเมทาโนเจน การคัดแยกให้เจริญแบบเดี่ยวๆ จะใช้เวลานานกว่าการเลี้ยงคู่ ลักษณะสัณฐานวิทยาของ AF มีวงจรชีวิตที่เป็น สปอร์ และ เส้นใย การส่องกล้องจุลทรรศน์ ดูรูปร่างจะต้องสังเกตเป็นระยะ ๆ มีความถี่ การสังเกตรูปร่างเพียงอย่างเดียวจะทำให้เข้าใจผิดได้ การใช้เทคนิคระดับโมเลกุล ในการจำแนกสายพันธุ์ จะต้องใช้ขั้นตอนมากกว่า เพื่อจะลำดับนิวคลีโอไทด์ให้ครอบคลุม  ในการศึกษานี้จะใช้ วิธี ITS1 metagenomic target gene เพื่อหาชนิดและความบริสุทธิ์ เนื่องจากวิธีนี้จะสามารถเพิ่มปริมาณและวิเคราะห์ชิ้นส่วน DNA ได้ 10,000-100,000 ชิ้นในเวลาเดียวกัน และหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วย sanger sequencing เป็นวิธีการที่เป็นที่ยอมรับโดยทั่วไปในการจำแนกเชื้อที่แน่ใจว่าบริสุทธิ์ จะหาลำดับลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง ITS1 ถึง 28S ที่จะหาทั้งชิ้นใหญ่ และ ชิ้นส่วนสั้น ๆ ในตำแหน่ง ITS1 5.8S ITS2 และ 28S เมื่อได้เชื้อ AF บริสุทธิ์ ทำการทดสอบประสิทธิภาพการย่อยสายชีวมวลที่เป็นลิกโนเซลลูโลส โดยใช้ฟางข้าว การย่อยสายเซลลูโลส โดยใช้ Microcrystalline cellulose (MCC) การย่อยสลายเฮมิเซลลูโลส โดยใช้ไซแลน ผลที่คากว่าจะได้รับในปีที่ 1 คือเชื้อ AF บริสุทธิ์อย่างน้อย 1 ตัว เพื่อใช้เป็นแหล่งเชื้อเพิ่มประสิทธิภาพการย่อยสลายฟางข้าวและเชื้อต้นแบบในการศึกษา genomics and transcriptomics sequencing ในปีต่อไป

          แผนดำเนินงานปีที่ 2 จะวิเคราะห์หาศักยภาพและบทบาทหน้าที่ AF ที่คัดแยกได้ในปีที่ 1 ด้วยวิธี Genomics และ Transcriptomics sequencing โดยเลี้ยง AF ใน ฟางข้าว MCC และไซแลน สกัด DNA จาก MCC เพื่อส่ง Genomics sequencing และ สกัด RNA จาก ฟางข้าว MCC และไซแลน เพื่อส่ง Transcriptomics sequencing  ผลจากลำดับนิวคลีโอไทด์ วิเคราะห์หาขนาดจีโนม เปอร์เซ็นต์ TA content จำนวนยีนส์ทั้งหมด และจำนวน CAZyme ยีนส์ จัดข้อมูลออกแบบ PCR marker เพื่อตรวจสอบ AF และ CAZyme ยีนส์ที่สำคัญเพื่อดูการแสดงออกของเอ็นไซม์เมื่อมีการย่อยสลาย จากนั้นการทดสอบประสิทธิภาพของ AF ในการเป็นหัวเชื้อ Bioaugmentation และการคงทนของ AF ในระบบ ฟางข้าวจะถูกหมักร่วมกับหัวเชื้อ Anaerobic lignocellulolytic microbial consortium (ALMC) ที่มาจากกระเพาะควาย ที่ใช้ฟางข้าวเป็นแหล่งอาหาร ไม่มีการกดการเจริญของแบคทีเรียด้วยสารปฏิชีวนะ  ในช่วงต้นของการศึกษาที่ผ่านมา พบว่า มีเชื้อแบคที่เรียเป็นส่วนใหญ่ มีประสิทธิภาพในการย่อยฟางข้าว 86% และเปลี่ยนฟางข้าวเป็นก๊าซชีวภาพ 310 mL/g ในเวลา 40 วัน คาดหวังว่าการเติมเชื้อ AF ที่คัดแยกเข้าไปในระบบนี้ จะช่วยเพิ่มอัตราการย่อยฟางข้าวได้เร็วขึ้น และเปลี่ยนฟางข้าวเป็นก๊าซชีวภาพได้มากขึ้น ระหว่างการหมักจะเก็บตัวอย่างเพื่อสกัด DNA มาตรวจสอบ AF และ CAZyme ยีนส์ ด้วยวิธี qPCR เป็นระยะเพื่อคาดการณ์ปริมาณและกิจกรรมของ AF ในถังหมัก คาดหวังว่าจะสามารถเลี้ยง AF ให้คงอยู่และมีกิจกรรมที่ดี ส่งเสริมการเปลี่ยนฟางข้าวเป็นก๊าซชีวภาพได้ดีและยั่งยืนมากขึ้น

          จากแผนการศึกษาในระยะ 2 ปี ผลที่คาดว่าจะได้รับหรือนำไปใช้ในอนาคต คือ การประยุกต์ใช้เชื้อ AF ที่ได้นี้กับชีวมวลชนิดอื่นๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และส่งเสริมการผลิตก๊าซชีวภาพจากชีวมวล