Method validation of a rapid paper-based test strip in combination with immunomagnetic separation for detection of Salmonella Typhimurium

ซาลโมเนลล่า ไทฟิมูเรียม (Salmonella Typhimurium; S. Typhimurium) เป็นหนึ่งในจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหาร (foodborne pathogens) ซึ่งเป็นสาเหตุหลักในการทำให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษ โดยการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ก่อโรคชนิดนี้เป็นปัญหาที่ส่งผลกระทบในด้านต่างๆ ได้แก่ ปัญหาด้านสุขภาพของผู้บริโภค ด้านเศรษฐกิจ และอุตสาหกรรมการส่งออกอีกด้วย การปนเปื้อนของเชื้อ S. Typhimurium ในผลิตภัณฑ์ต่างๆ อาทิเช่น เนื้อสัตว์แช่แข็งหรือแปรรูป อาจจะส่งผลให้ประเทศผู้นำเข้าผลิตภัณฑ์เหล่านี้มีความเชื่อมั่นที่ลดลงต่อประเทศไทยในฐานะผู้ผลิตและส่งออก และอาจนำไปสู่การกีดกันทางการค้าได้ ดังนั้นแล้ววิธีการที่รวดเร็วถูกต้องและมีความแม่นยำสูง จึงมีความสำคัญเป็นอย่างมากในการตรวจสอบการปนเปื้อนของเชื้อ S. Typhimurium ในผลิตภัณฑ์อาหารก่อนส่งออกไปจำหน่ายในต่างประเทศ  โดยทั่วไปการตรวจสอบเชื้อ Salmonella ในอาหารจะปฏิบัติตามวิธีมาตรฐาน ISO 6579–1 ซึ่งประกอบด้วยหลายขั้นตอน ได้แก่ ขั้นตอนการเพิ่มจำนวน (enrichment) การเพาะเลี้ยงเชื้อ (selective culture) และการตรวจยืนยันเชื้อ (Confirmation) โดยใช้ระยะเวลายาวนานถึง 5-7 วัน ซึ่งถือว่าเป็นปัญหาอย่างมากในขั้นตอนการตรวจปล่อยสินค้าในทางอุตสาหกรรม อันเนื่องมาจากว่าใช้ระยะเวลานานเกินไป อาจจะส่งผลกระทบต่ออายุของตัวอย่างผลิตภัณฑ์ที่ส่งออก อีกทั้งยังมีค่าใช้จ่ายที่สูงอีกด้วย  

    ในปัจจุบันความต้องการบริโภคเนื้อไก่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องทั่วโลก และประเทศไทยก็เป็นผู้ผลิตและส่งออกเนื้อสัตว์ไก่เป็นอันดับที่ 4 ของโลกที่มีปริมาณการส่งออก 930,000 ตันต่อปีโดยประมาณ (Prasertsri, 2021 และ Shahbandeh, 2022) ไปยังภูมิภาคเอเชีย ยุโรป และอเมริกา โดยกรมปศุสัตว์ได้กำหนดว่าต้องไม่พบเชื้อ Salmonella ในตัวอย่างอาหาร 25 กรัม (ประกาศกรมปศุสัตว์, 2544) เพื่อยืนยันความปลอดภัยของผลิตภัณฑ์ก่อนส่งออก  ในปัจจุบันได้มีการพัฒนาวิธีตรวจสอบเชื้อแบบรวดเร็ว (rapid pathogen detection) โดยหนึ่งในวิธีที่นิยมในปัจจุบันเน้นการตรวจสอบระดับโมเลกุล เช่น กรดนิวคลีอิก โดยการทำพีซีอาร์ (Polymerase chain reaction; PCR) ซึ่งเป็นวิธีรวดเร็วที่มีความจำเพาะสูง เป็นการเพิ่มจำนวนชิ้นยีนจำเพาะที่เป็นชิ้นยีนเป้าหมายของเชื้อทดสอบชนิดนั้นๆ แต่ข้อเสียของวิธีการนี้คือ เมื่อประยุกต์ใช้ในการตรวจเชื้อในตัวอย่างอาหาร องค์ประกอบของอาหาร เช่น ไขมันและโปรตีนอาจจะรบกวนการเกิดปฏิกิริยา (food matrix interference) หรือบดบังชิ้นยีนที่สำคัญ ทำให้ประสิทธิภาพในการตรวจสอบลดลง และมีความยุ่งยากในการวิเคราะห์ผล เนื่องจากต้องใช้ร่วมกับเทคนิค Gel electrophoresis ซึ่งต้องใช้เครื่องมือและอุปกรณ์ราคาสูงในการวิเคราะห์ผล

    ผู้วิจัยได้ตระหนักถึงความสำคัญในการตรวจเชื้อ S. Typhimurium ในอุตสาหกรรมอาหาร จึงได้พัฒนาวิธีทางเลือกที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพเพื่อสะดวกต่อการใช้งานเพื่อลดกระบวนการเพิ่มจำนวนเชื้อเป้าหมายและคัดแยกเชื้อเป้าหมายออกจากตัวอย่างอาหารตามวิธีมาตรฐาน โดยใช้หลักการ immunomagnetic separation (IMS) ร่วมกับแผ่นทดสอบแบบกระดาษ (Paper-based test strip) โดยในขั้นตอน IMS จะใช้อนุภาคแม่เหล็กระดับนาโน (ferromagnetic nanoparticle; FMN) เชื่อมติดกับแอนติบอดี (antibody) ที่จำเพาะต่อเชื้อ S. Typhimurium (Ab-FMNs) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของเชื้อ โดยการใช้สมบัติความเป็นแม่เหล็กดูดจับเชื้อเป้าหมาย (โดยไม่ต้องอาศัยการ enrichment ซึ่งใช้เวลานาน) และแยกเชื้อเป้าหมายออกจากสารละลายจากปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจน (antigen) ที่ผิวเซลล์และ antibody ที่ตรึงอยู่บนอนุภาคแม่เหล็ก เพื่อแยกจุลินทรีย์เป้าหมายออกจากตัวอย่างอาหาร และนำไปเพิ่มจำนวนชิ้นยีนที่จำเพาะโดยวิธีการ PCR และอ่านผล โดยใช้ Paper-based test strip อาศัยหลักการ immunochromatography ซึ่งใช้อนุภาคทองระดับนาโน (AuNPs) ที่เชื่อมติดกับ antibody ที่จำเพาะกับผลิตภัณฑ์จากพีซีอาร์ (PCR product) เป็นตัวให้สัญญาณ ซึ่งจะแสดงผลจากการเคลื่อนที่ไปทำปฏิกิริยาที่บริเวณเส้นทดสอบ (test line) และ เส้นควบคุม (control line) วิธีอ่านผลนี้มีความสะดวกกว่าการทำ gel electrophoresis มาก เนื่องจากไม่จำเป็นต้องใช้เครื่องมือที่ซับซ้อนและราคาแพง รวมถึงผู้เชี่ยวชาญในการทำการวิเคราะห์ โดยผู้อ่านผลเพียงแค่หยดตัวอย่างลงในแผ่นทดสอบจากนั้นสังเกตแถบสีที่ปรากฎขึ้น ซึ่งการวิเคราะห์โดยใช้ Paper-based test strip สามารถบอกผลได้ทั้งเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณจากการสังเกตความเข้ม-จาง  โดยเมื่อได้ชุดทดสอบต้นแบบแล้ว

    แต่อย่างไรก็ตามชุดทดสอบรวดเร็วแบบกระดาษร่วมกับ immunomagnetic separation สำหรับเชื้อ S. Typhimurium ที่พัฒนาขึ้น (ได้ขอทุนวิจัย 1 ปี ปีงบประมาณ 2566 สำหรับพัฒนาชุดทดสอบรวดเร็ว) ยังมีความจำเป็นต้องผ่านการทดสอบความถูกต้องของชุดทดสอบ (method validation) ตามมาตรฐาน ISO16140-2 ต่อไปเพื่อยืนยันว่าชุดทดสอบดังกล่าวสามารถใช้ตรวจสอบเชื้อได้จริง และมีความถูกต้องแม่นยำเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐาน ISO 6579–1 ฉะนั้นแล้วคณะผู้วิจัยจึงเล็งเห็นว่าการตรวจสอบความถูกต้องของชุดทดสอบตามมาตรฐาน ISO16140-2 จะเป็นจุดเริ่มต้นที่จะสามารถนำชุดทดสอบรวดเร็วแบบกระดาษร่วมกับ immunomagnetic separation ไปใช้งานได้จริง และสามารถผลิตเป็นชุดทดสอบทางการค้าในเชิงพาณิชย์ได้ นอกจากนี้หากงานวิจัยนี้ประสบความสำเร็จ และให้ผลการทดสอบเป็นไปตามข้อกำหนดในมาตรฐาน ISO16140-2  จะสามารถนำไปประยุกต์ใช้กับเชื้อเป้าหมายอื่นๆ โดยการเปลี่ยนสารชีวโมเลกุลตัวกลาง รวมถึงสามารถนำไปพัฒนาเป็นชุดทดสอบทางการค้าเพื่อใช้จริงในอุตสาหกรรมได้ ซึ่งจะส่งผลให้สามารถลดเวลาในการตรวจเชื้อก่อโรคในอาหารเพื่อเพิ่มความปลอดภัยในอาหารได้ทางหนึ่ง