Immobilization of laccase and redox mediator by adsorption onto biochar and entrapment in calcium alginate for enhanced textile decolorization and reduced toxicity

เอนไซม์แลคเคสเป็นเอนไซม์ที่มีคอปเปอร์เป็นองค์ประกอบ (multicopper oxidase) มีความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารในกลุ่มฟีนอลิก เช่น ลิกนิน กัวไอเอคอล (guaiacol) 2,6-dimethoxyohenol และสารที่ไม่ใช่สารประกอบฟีนอลิก เช่น aromatic amine, polycyclic aromatic hydrocarbon และสามารถกำจัดสีสังเคราะห์ได้ดีเมื่อเอนไซม์แลคเคสทำงานร่วมกับตัวกลางรีดอกซ์ (redox mediator) ซึ่งทำหน้าที่รับอิเล็กตรอนจากเอนไซม์เพื่อไปรีดิวซ์ซับสเตรต ซึ่งระบบแลคเคสและตัวกลาง (laccase-mediator system) เป็นที่นิยมศึกษาอย่างมากเพื่อนำไปใช้กำจัดสี ยาฆ่าวัชพืชและแมลง ซึ่งมักปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อม

            ก่อนหน้านี้กลุ่มวิจัย LigniTech-Lignin Technology Research Group คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี ได้ศึกษาและพัฒนากระบวนการผลิตเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อTrametes sp. 56M8 KKN และระบบlaccase-mediator system โดยใช้ ABTS และ syringaldehyde เป็น redox mediator โดยทำการผลิตเอนไซม์ด้วยการเพาะเลี้ยงเชื้อ Trametes sp. 56M8 KKN บนชานอ้อยแบบ  Solid State Fermentation (SSF) และนำมาสกัดเอนไซม์หยาบ (crude enzyme) ศึกษาคุณสมบัติทางชีวเคมีของเอนไซม์พบว่า เอนไซม์หยาบมีกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสที่สูงมาก ทำงานได้ดีในช่วง pH 4-5 และอุณหภูมิ 40-60 °C และยังกำจัดสีในกำจัดสีในกลุ่มanthraquinone เช่น Remazol Brilliant Blue R (RBBR) ได้ดี โดยสามารถลดสีได้สูงถึง 80% ไดยไม่ต้องใช้ตัวกลางรีดอกซ์ นอกจากนี้ยังสามารถกำจัดสีในกลุ่มอินดิโก (indigo) เช่น อินดิโกคาร์มีน (indigo carmine) ได้ถึง 80% ในเวลา 16 ชั่วโมง และเมื่อใช้ระบบ laccase-mediator โดยใช้ ABTS และ syringaldehyde  เป็น mediator จะช่วยลดสีได้ 100% และลดเวลาจาก 16 ชั่งโมงเป็น 3 ชั่วโมง

            อย่างไรก็ดี การใช้เอนไซม์แลคเคสจากเชื้อ Trametes sp. 56M8 KKN ยังมีข้อจำกัดบางประการโดยเฉพาะสเถียรภาพของเอนไซม์ (enzyme stability) เมื่อทำงานในสภาวะที่มีอุณหภูมิสูง และเอนไซม์มีช่วงค่า pH ในการทำที่แคบ ซึ่งอุณหภูมิและ pH จะมีผลต่อโครงรูปเอนไซม์ (conformation) ซึ่งมักส่งผลต่อรูปร่างบริเวณเร่ง (active site) ทำให้การเร่งปฏิกิริยาเกิดได้ไม่ดีนักหรือเอนไซม์มักเสียสภาพการทำงาน การตรีงเอนไซม์ (immobilize) ไว้กับวัสดุค้ำจุน (support or carrier) หรือการกำจัดการเคลื่อนที่ของเอนไซม์ เป็นอีกหนึ่งทางเลือกที่จะช่วยรักษาโครงรูปและการทำงานของเอนไซม์ได้ ซึ่งมีรายงานว่า การตรึงเอนไซม์สามารถเพิ่มเสถียรภาพของเอนไซม์โดยการรักษาโครงรูปโดยเฉพาะบริเวณเร่งปฏิกิริยา ช่วยให้เอนไซม์คงทนต่อสภาพแวดล้อม เช่น อุณหภูมิ pH ได้ดียิ่งขึ้น และปรับปรุงคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอนไซม์ (enzyme kinetics) อีกทั้งยังนำเอนไซม์กลับมาใช้ใหม่ได้ซึ่งเป็นการลดต้นทุนเนื่องจากเอนไซม์มีราคาสูง

             โดยทั่วไปการตรึงเอนไซม์สามารถทำได้หลายวิธี เช่น การตรึงทางกายภาพ (physical) ด้วยเทคนิคดูดซับ (adsorption) การยึดในร่างแหพอลิเมอร์(entrapment) การตรึงทางเคมี (chemical) ด้วยเทคนิคการสร้างพันธะโควาเลนต์ (covalent bonding) การสร้าง crosslink ระหว่างเอนไซม์และตัวยึด ซึ่งในงานวิจัยนี้ คณะผู้วิจัยสนใจการตรึงเอนไซม์แลคเคสและตัวกลางรีดอกซ์ด้วยวิธีทางกายภาพได้แก่ การดูดซับ และการยึดในร่างแหพอลิเมอร์ เนื่องจากเป็นกระบวนการที่ไม่กระทบต่อโครงสร้างของเอนไซม์มากนัก และเอนไซม์สามารถหรือมีโอกาสเจอกับซับสเตรตได้ง่าย นอกจากนี้การตรึงเอนไซม์ร่วมกับตัวกลางรีดอกซ์ยังมีการศึกษาน้อย และการหาสัดส่วนของเอนไซม์และตัวกลางรีดอกซ์ มีความสำคัญมากเนื่องจากตัวกลางรีดอกซ์เองสามารถลดกิจกรรม (activity) และเสถียรภาพ(stability) ของเอนไซม์แลคเคสได้เช่นกัน 

            ดังนั้นงานวิจัยจะสร้างความรู้ความเข้าใจของระบบ laccase-mediator system เมื่อถูกตรึงด้วยวิธีดูดซับ และการยึดในร่างแหพอลิเมอร์ โดยตัวยึดสำหรับการตรึงเอนไซม์ด้วยวิธีดูดซับจะเลือกใช้ถ่านชีวภาพ (biochar) เนื่องจากมีหมู่ฟังก์ชันอิสระบนผิว (surface free functional groups)  จำนวนมาก เช่น หมู่โฮดรอกซิล อัลดีไฮด์ คีโตน เป็นต้น ซึ่งสามารถเกิดการสร้างพันธะ electrostatic interaction กับเอนไซม์และตัวกลางซึ่งมักมีหมู่เอมีน ไฮดรอกไซล คาร์บอกซิลอิสระได้ และเลือกแอลจีเนตเป็นพอลิเมอร์ในการสร้างร่างแหสำหรับตรึงเอนไซม์เนื่องจากเป็นพลอิเมอร์ธรรมาชาติและสามารถควบคุมขนาดรู (porosity)ได้เพื่อไม่ให้เอนไซม์และตัวกลางรีดอกซ์หลุดออกระหว่างทำปฏิกิริยา ทำการศึกษาคุณโครงสร้าง (morphology) ของถ่านชีวภาพและเม็ดแอลจีเนตก่อนและหลังตรึงเอนไซม์แลคเคสร่วมกับตัวกลางรีดอกซ์ ศึกษาสมบัติทางชีวเคมีของเอนไซม์ อัตราการเร่งปฏิกิริยา และค่าจลศาสตร์เปรียบเทียบระหว่างเอนไซม์แลคเคสอิสระและที่ถูกตรึงด้วยวิธีต่าง ๆ จากนั้นนำไปศึกษาการกำจัดสีอินดิโกคาร์มีนและ RBRR และทดสอบความเป็นพิษของผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการย่อยสีดังกล่าว ซึ่งงานวิจัยจะสร้างองค์ความรู้และพัฒนากรรมวิธีการตรึงเอนไซม์เพื่อนำไปประยุกต์ใช้การปนเปื้อนในแหล่งน้ำหรือการลดความเป็นพิษของสารเคมี และต่อยอดไปถึงการกำจัดสารพิษ เช่น ยากำจัดวัชพิชและยาฆ่าแมลงต่อในอนาคต

            งานวิจัยนี้สร้างองค์ความรู้พื้นฐานและเป้าหมายตีพิมพ์ผลงานในวารสารวิชาการระดับนานาชาติที่มีค่า Impact factor  จำนวน 1 บทความ การเผยแพร่ผลงานวิจัยในที่ประชุมวิชาการระดับนานาชาติ 1 ครั้ง