การพัฒนานาโนบอดีที่จำเพาะกับ Epidermal growth factor receptor (EGFR) ในการรักษาโรคมะเร็ง

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) คือไกลโคโปรตีนเมมเบรนขนาดประมาณ 170 kDa ซึ่งเป็นตัวรับในตระกูล receptor tyrosine protein kinase (RTK) ที่มีความสำคัญในการควบคุมการเจริญเติบโต (cell growth), ดีฟเฟอเรนชิเอชัน (differentiation), การแปรรูป (transformation), การสร้างหลอดเลือดใหม่ (angiogenesis), การเคลื่อนที่ (migration) และการอยู่รอด (survival) ของเซลล์ โดย EGFR เป็นตัวรับกลุ่ม ErbB ประกอบด้วย EGFR หรือ ErbB1 หรือ Her-1, ErbB2 (Her-2), ErbB3 (Her-3) และErbB4 (Her-4)  โดยการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นทำให้เกิดการกระตุ้นเอนไซม์ Tyrosine Kinase ส่งผลทำให้เกิดการส่งสัญญาณไปยังนิวเคลียส เกิดการแบ่งตัวของเซลล์มะเร็งขึ้นชนิด EGFR mutation โดย EGFR จะมีการแสดงออกมากเกินไปในมะเร็งบางชนิด อาทิเช่น มะเร็งศีรษะและลำคอ (100%), มะเร็งปอดชนิด non-small cell lung cancer (90%), มะเร็งลำไส้ (80%), มะเร็งต่อมลูกหมาก และมะเร็งเต้านม (70%) ดังนั้นโปรตีน EGFR จึงเป็นเป้าหมายที่เหมาะสมสำหรับการรักษามะเร็ง

การรักษามะเร็งด้วยการใช้ยามุ่งเป้า (Targeted therapy) แบ่งเป็น 2 กลุ่มหลักได้แก่ 1. ยาโมโนโคลนอลแอนติบอดี (monoclonal antibody; mAb) และ 2. ยาโมเลกุลขนาดเล็กได้แก่ยายับยั้งโปรตีนไคเนส (kinase inhibitor)   แอนติบอดีหรือสารภูมิต้านทานนั้นเป็นโมเลกุลขนาดใหญ่ (macromolecules) ประเภทแรก ๆ ที่ถูกเลือกใช้ในการนำส่งยาเข้าสู่ร่างกายแบบมุ่งเป้า mAb นั้นถูกใช้ในทางการแพทย์มานานนับทศวรรษแล้ว  ตัวอย่างของ anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) mAb ที่ใช้ในการรักษามะเร็งอยู่ในปัจจุบัน ได้แก่ 1) cetuximab 2) panitumumab และ 3) matuzumab  อย่างไรก็ดีการใช้ mAb ในการรักษาโรคมะเร็งนั้นยังมีข้อจำกัดในหลายด้าน อาทิเช่น การแทรกซึมเข้าสู่เนื้องอก ซึ่งเกิดจากขนาดที่ใหญ่ของแอนติบอดี ซึ่งแอนติบอดีมีขนาดประมาณ 14.2 นาโนเมตร × 8.2 นาโนเมตร × 3.8 นาโนเมตร รวมถึงมีมวลประมาณ 150 kDa ซึ่งถือว่าค่อนข้างมาก ปัจจัยเรื่องขนาดและน้ำหนักส่งผลต่อการทะลุทะลวงเข้าสู่เนื้องอกเป้าหมาย จากการศึกษาแบบ In vivo พบว่ามีเพียงร้อยละ 0.001 – 0.01 ของแอนติบอดีที่ฉีดเข้าสู่ร่างกายต่อเนื้องอก 1 กรัมเท่านั้นที่สามารถเข้าถึงเป้าหมายได้ ซึ่งผลจากการที่ระดับความเข้มข้นของแอนติบอดีต่ำกว่าที่เหมาะสม (suboptimal antibody concentration) ทำให้ร่างกายผู้ป่วยจำนวนมากเกิดการต่อต้านการรักษาด้วยแอนติบอดีทำให้การรักษาล้มเหลวบ่อยครั้งมากขึ้น นอกจากนี้แอนติบอดียังมีจุดอ่อนอื่นๆ อาทิเช่น มีความเปราะบาง (fragility) ทำให้ต้องนำเข้าสู่ร่างกายโดยการจ่ายเข้าทางหลอดเลือดดำ (intravenous) หรือการฉีดเข้าใต้ผิวหนัง (subcutaneous) เท่านั้น อีกทั้งโครงสร้างที่ซับซ้อนแบบ hetero-tetrameric การเปลี่ยนแปลงแบบ posttranslational modifications ทำให้ต้องผลิตแอนติบอดีเหล่านี้จากระบบเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนมเท่านั้นซึ่งระบบการผลิตนี้จะต้องใช้งบประมาณจำนวนมากในการผลิตแบบขนาดใหญ่ทำให้การรักษาโดยใช้ mAb มีราคาสูงมาก   ดังนั้นเพื่อเอาชนะข้อจำกัดเหล่านี้จึงมีการพัฒนาโมเลกุลที่น่าสนใจอีกรูปแบบหนึ่ง นั้นคือนาโนบอดี   ในปี ค.ศ. 1989 ได้มีการระบุแอนติบอดีชนิดใหม่เป็นครั้งแรกในซีรั่มของอูฐที่มีหนอกเดียว (dromedaries) และต่อมาด้วยในสายพันธุ์อื่น ๆ ของตระกูล Camelidae  แอนติบอดีเหล่านี้มีความพิเศษคือไม่มี light chain และไม่มี constant heavy domain ชิ้นแรก (CH1) และ ถูกเรียกว่า heavy-chain only antibody (HcAb)   “นาโนบอดี (Nanobody)” คือชิ้นส่วนแอนติบอดีที่มีองค์ประกอบเป็นเพียง monomeric variable antibody domain เพียงชิ้นเดียวที่พัฒนามาจาก variable region ของ HcAb ทําให้นาโนบอดีเป็นชิ้นส่วนแอนติบอดีที่มีขนาดเล็กที่สุดที่ยังสามารถจับกับแอนติเจนได้อย่างจําเพาะ   โดยนาโนบอดีมีคุณสมบัติที่น่าสนใจคือมีขนาดที่เล็ก มีน้ำหนักโมเลกุลเพียง 15 kDa ซึ่งต่ำกว่า mAbs ทั่วไปประมาณ 10 เท่า จึงมีความสามารถในการแทรกซึมเข้าสู่เนื้องอกได้สูง และการขจัดออกจากเลือดได้อย่างรวดเร็ว อีกทั้งยังสามารถคอนจูเกต (conjugate) กับสารอื่น ๆ ได้ง่าย ถ้าเทียบกับแอนติบอดีแบบดั้งเดิม นาโนบอดียังมีคุณสมบัติอื่น ๆ ที่ดีกว่า เช่น ขนาดที่เล็กถึงระดับนาโน, โครงสร้างมีความทนทานต่อ การเปลี่ยนแปลงทานอุณหภูมิ สารเคมีและสภาวะกรดด่างสูง ๆ ได้ ทําให้มีศักยภาพในการนำส่งนาโนบอดีเข้าสู่ร่างกายทั้งทางเส้นเลือดดำ (intravenous) การกลืนกินทางปาก (oral) การจ่ายเข้าทางเยื่อบุช่องท้อง (intraperitoneal) และการฉีดเข้าสู่เนื้องอกโดยตรง (intratumor)  นาโนบอดียังมีคุณสมบัติในการละลายน้ำได้สูง (high solubility), การม้วนพับสามารถคืนรูปได้ (refolding) มีประสิทธิภาพในการจับและความจําเพาะเจาะจงกับ target เดียวส่งผลให้มีผลข้างเคียงที่ต่ำกว่าและประสิทธิภาพที่ดีขึ้นเมื่อเทียบกับยาแบบสารเคมีที่ใช้อยู่ในปัจจุบัน, สามารถเข้าถึงในบริเวณที่ เข้าถึงได้ยากและสามารถเจาะทะลุทะลวงเข้าสู่เนื้อเยื่อที่ต้องการได้ดีกว่ายาแบบ mAbs  นอกจากนี้ นาโนบอดียังสามารถผลิตได้ดีใน เซลล์ชนิดอื่น ๆ นอกเหนือจากเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เพราะลักษณะตามธรรมชาติของ VHH ที่เป็นโดเมนเดี่ยวและการมี ความสามารถในการละลายน้ำที่สูงขึ้น ทําให้สามารถผลิต VHH ในเซลล์เจ้าบ้านจําพวกอีโคไลได้ในปริมาณสูง  ทำให้มีต้นทุนการผลิตต่ำกว่าเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมาก  คุณสมบัติเด่นอันนี้นี่เองที่ทําให้การประยุกต์ใช้นาโนบอดีในทางอุตสาหกรรมเพื่อทดแทนแอนติบอดีแบบดั้งเดิมเป็นความคิดใหม่ที่กําลังเป็นที่นิยม        

          Anti-EGFR นาโนบอดีนับเป็นนาโนบอดีชนิดแรกที่ได้รับการพัฒนาขึ้นตั้งแต่ปีค.ศ. 2007 โดย Roovers และคณะได้เผยแพร่ความสำเร็จครั้งแรกของการใช้นาโนบอดีในการรักษาสำหรับก้อนเนื้องอก (solid tumor) ในร่างกาย (in vivo) ซึ่งพบว่า anti-EGFR นาโนบอดีสามารถชะลอการเติบโตของเนื้องอกอย่างมีประสิทธิภาพ และต่อมาได้พัฒนารูปแบบสองพาราโทปิกที่สามารถลด EGFR activation ได้ดีกว่า โดยมีประสิทธิภาพเทียบเท่ากับ cetuximab ที่เป็น mAb  นอกจากนี้ นาโนบอดีรูปแบบต่างๆ ได้รับการพัฒนาและศึกษาเพิ่มเติม เช่น นาโนบอดีที่จำเพาะกับ dimer interface ของ EGFR, EGFR-tyrosine kinase รวมทั้ง EGFR-ectodomains ซึ่งเป็นที่น่าสนใจว่านาโนบอดีชนิดนี้สามารถเอาชนะปัญหาเรื่องการดื้อต่อการรักษาที่พบในการรักษาด้วย mAbs  จนถึงปัจจุบันนาโนบอดีที่จำเพาะต่อ extracellular domain ของ EGFR หลายตัวได้ถูกพัฒนาสำหรับการประยุกต์ใช้กับการรักษามะเร็งแบบมุ่งเป้า  ศักยภาพของนาโนบอดีที่จำเพาะต่อ EGFR ในการรักษามะเร็งไม่เพียงแต่เกิดจากความสามารถในการยับยั้งการทำงานของ EGFR เท่านั้น  งานวิจัยอื่น ๆ ยังแสดงให้เห็นว่านาโนบอดีสามารถใช้เป็นตัวนำส่งยาและสิ่งอื่น ๆ ในการรักษาแบบมุ่งเป้า ด้วยความสามารถนี้ทำให้ไม่เกิดความเป็นพิษในวงกว้างมากนัก

ในการคัดเลือกนาโนบอดีที่มีความจําเพาะกับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เราสนใจนั้นจะถูกคัดเลือกมาจาก synthetic camelized human nanobody library ซึ่งมีขนาด library มากถึง 10⁹ โคลน ดังนั้นจึงมีความต้องการกระบวนการคัดเลือกที่มีประสิทธิภาพ ซึ่ง หนึ่งวิธีการที่ใช้กันแพร่หลายคือ yeast display ซึ่งอาศัยความสัมพันธ์ในการจับกันของ receptor และ ligand โดยเทคนิคนี้เป็นการโคลน ยีน receptor เข้าไปยัง yeast เพื่อให้เกิดการผลิต receptor ที่ผิว  จากนั้นทําการเคลือบ ligand ที่สนใจลงใน solid support ซึ่ง yeast ที่ผลิต receptor จะจับอย่างจําเพาะกับ ligand ส่งผลให้สามารถคัดเลือก yeast ที่มีความสามารถในการผลิต receptor ที่มี ความจําเพาะกับ ligand ที่เราสนใจได้ ซึ่งข้อดีของเทคนิค yeast display คือ สามารถคัดเลือก receptor ที่มีความจําเพาะกับ ligand ในจํานวนที่สูง  แต่ข้อเสียคือเทคนิคนี้เป็นเทคนิคแบบ in vitro ทําให้ในขั้นตอนของการคัดเลือกนาโนบอดีที่ดีที่สุดยังจําเป็นต้องอาศัย การศึกษาคุณสมบัติของ individual hits จํานวนมากด้วยเทคนิคทาง in vitro อื่น ๆ อีก ซึ่งทําให้เสียเวลา แรงงานและทรัพยากร โครงงานวิจัยนี้จึงต้องการนําอีกกระบวนการหนึ่งที่จําเพาะกับการคัดเลือกโปรตีนสองตัวที่จับกัน คือ กระบวนการ FLI-TRAP (Functional Ligand-binding Identification by Tat-based Recognition of Associating Proteins) ซึ่งเป็นกระบวนการการคัดเลือกแบบ in vivo ซึ่งประยุกต์ใช้กลไก hitchhiker’s จาก Twin-arginine translocation (Tat) pathway ของแบคทีเรีย เทคนิคนี้ถูกพัฒนาขึ้นโดยผศ.ดร.ดุจเดือน วราโห (หัวหน้าโครงการ) และ Prof. Dr. Matthe DeLisa ในปีค.ศ. 2009 โดยการนำ Tat signal sequence (บริเวณสัญญาณ เปปไทด์ที่ทําหน้าที่ส่งสัญญาณให้ Tat pathway ทําการขนส่งโปรตีนที่มีสัญญาณเปปไทด์นี้อยู่จากไซโตพลาสซึมไปยังเพอริพลาสซึม)  ไปเชื่อมที่ N-terminus ของแอนติบอดี และนํา reporter protein ไปเชื่อมที่ C-terminus ของแอนติเจน เมื่อแอนติเจนจับกับแอนติบอดีก็จะทําให้โปรตีนคอมเพล็กส์ถูกนําส่งออกไปยังเพอริพลาสซึมพร้อมกัน โดยอาศัยกลไก hitchhiker โดยที่ reporter protein ที่เลือกใช้คือเอนไซม์ Beta-lactamase หรือ Bla ซึ่งมีความพิเศษคือเมื่อเอนไซม์นี้อยู่ในไซโตพลาสซึมจะไม่สามารถทําให้เซลล์ทนยาปฏิชีวนะจําพวกเบต้าแลคเทมริงค์  เช่น แอมพิซิลลิน และ คาร์เบนิซิลลินได้  แต่เมื่ออยู่ในเพอริพลาสซึมจะทําการตัดทําลายยาปฏิชีวนะจําพวกนี้ และทําให้เซลล์สามารถเติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะอยู่ได้  ดังนั้น เมื่อแอนติเจนจับกับแอนติบอดี โปรตีน คอมเพล็กส์ก็ถูกนําส่งออกไปยังเพอริพลาสซึมดังที่กล่าวมาแล้ว ทําให้เราสามารถคัดเลือกแอนติบอดีที่จับกับแอนติเจนที่ต้องการได้ โดยง่ายและราคาถูก โดยการเพลทเซลล์แบคทีเรียที่มีพลาสมิดที่มีองค์ประกอบของโปรตีนที่ถูกโคลนให้อยู่ในรูปแบบการคัดเลือก FLI-TRAP นี้บนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะจําพวกเบต้าแลคเทมริงค์อยู่  ก็สามารถทําการคัดเลือกนาโนบอดีที่จับได้ดีกับแอนติเจนที่ ต้องการได้ทีละหมื่นหรือแสนตัวอย่าง จึงสะดวกกว่าวิธี yeast display มาก แต่ข้อเสียของวิธีการทาง in vivo นี้คือไม่สามารถทําการ คัดเลือกได้กับตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่เกินไป เช่น nanobody library ที่เราต้องการใช้ซึ่งมีขนาด 10⁹ โคลน นอกจากนี้เทคนิคนี้ยังถูก แสดงให้เห็นแล้วว่ามีประสิทธิภาพสูงในการคัดเลือก stable และ soluble antibody-antigen complex ดังนั้นการผสมผสานเทคนิค yeast display เข้ากับ FLI-TRAP ก็จะทําให้กระบวนการคัดเลือกนาโนบอดีมีประสิทธิภาพมากขึ้น  ทั้งด้านลดเวลา แรงงาน ค่าใช้จ่าย และสามารถคัดเลือกนาโนบอดีที่มีประสิทธิภาพสูงได้

สำหรับข้อเสนอโครงการนี้ คณะผู้วิจัยสนใจการพัฒนาโนบอดีซึ่งเป็นโดเมนขนาดเล็ก ๆ บน variable region ที่มีคุณสมบัติในการทำงานเหมือนแอนติบอดี แต่สามารถผลิตด้วยระบบ E. coli ที่มีราคาถูกและมีความซับซ้อนต่ำกว่าแอนติบอดี ทั้งนี้เพื่อให้ได้ตัวยาชีววัตถุที่พัฒนานั้นสามารถเข้าถึงกลุ่มผู้ป่วยได้อย่างทั่วถึง และ มีราคาต่ำ ทางผู้วิจัยคาดหวังว่าจะสามารถคัดเลือกนาโนบออดีที่มีประสิทธิภาพสูงในการจับกับ EGFR และ นำไปสู่การสร้างชีววัตถุใหม่เพื่อประยุกต์ใช้ในการรักษามะเร็ง โดยจะทำการศึกษาศักยภาพของนาโนบอดีที่คัดเลือกได้ในการยับยั้ง EGFR หากพบว่า นาโนบอดีที่คัดเลือกได้มีศักยภาพที่ดีพอ ก็นับว่าเป็นการพัฒนาเทคโนโลยีเพื่อเป็นการสร้างยาชีววัตถุที่สามารถผลักดันเข้าสู่บัญชีนวัตกรรมของประเทศไทยทำให้สามารถผลิต และจัดจำหน่ายตัวยาได้เองเพื่อเป็นการลดภาระค่าใช้จ่ายของประเทศอีกด้วย นอกจากนี้ ในอนาคตยังมีโอกาสนำต้นแบบที่ได้ไปศึกษาความเป็นไปได้ในการ conjugate เข้ากับ nanoparticles เพื่อใช้ในการนำส่งยาแบบ targeted therapy ต่อไปได้อีกด้วย โดยในการวิจัยชิ้นนี้ เน้นการประยุกต์ใช้ anti-EGFR นาโนบอดีกับมะเร็งสามชนิดคือ มะเร็งปอด มะเร็งลำไส้ใหญ่ และมะเร็งกระดูกชนิดคอร์โดมา ซึ่งสามารถพบได้มากขึ้นในประชากรสูงวัย