การคัดเลือกนาโนบอดีที่จำเพาะกับ interferon-gamma เพื่อใช้ในการพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อวัณโรคโค

วัณโรคในโค (bovine tuberculosis; bTB) เป็นหนึ่งในโรคระบาดในสัตว์ที่มีความสำคัญซึ่งเป็นผลมาจากการติดเชื้อแบคทีเรีย Mycobacterium bovis วัณโรคในโคมีวิธีตรวจวินิจฉัยมาตรฐาน (Gold standard diagnosis) ด้วยการตรวจสอบอินทราเดอร์มอล ทูเบอร์คูลิน (Intradermal tuberculin) ทั้งแบบเชิงเดี่ยว (Single intradermal tuberculin) และแบบเปรียบเทียบ (Single intradermal comparative tuberculin) แต่ทว่าวิธีดั้งเดิมนั้นมีความจำเพาะ (specificity) และความไว (sensitivity) ต่ำ นอกจากวิธีดังกล่าวยังมีวิธีการในการตรวจสอบโรควัณโรคในโคแบบ Interferon Gamma release assay (IGRA) โดยวิธีนี้มีรูปแบบกระบวนการคล้ายคลึงกับแบบ Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ในปัจจุบันนี้ ELISA นั้นใช้แอนติบอดีในรูปแบบ Immunoglobulin G (IgG) เป็นตัวตรวจสอบเป็นหลัก แต่ IgG นั้นมีราคาที่ค่อนข้างสูงเนื่องจากต้องผลิตจากเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนมในรูปแบบของโมโนโคลนอล แอนติบอดี (monoclonal antibody) หรือจากสัตว์มีชีวิตในรูปแบบ โพลีโคลนอล แอนติบอดี (polyclonal antibody) ทำให้ต้นทุนการทดสอบด้วย IGRA นี้มีต้นทุนในการทำการทดสอบที่สูงมากที่ประมาณ 110,000 บาท ต่อ 100 ตัวอย่าง

ดังนั้นหากสามารถนำแอนติบอดีรูปแบบใหม่หรือ นาโนบอดี (Nanobody) มาทดแทนแอนติบอดีตามปกตินั้นน่าจะเป็นทางเลือกที่ดีกว่าเนื่องจากนาโนบอดีมีคุณสมบัติที่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการใช้งาน เนื่องจากมีขนาดที่เล็กกว่า ทนทานต่อสภาพแวดล้อม และยังสามารถผลิตจากจุลชีพเช่น Escherichia coli (E. coli) ซึ่งมีต้นทุนในการผลิตที่ต่ำกว่ามาก ด้วยคุณสมบัติดังกล่าวทำให้นาโนบอดีเหมาะสมในการนำมาทำเป็นชุดตรวจโรค นอกจากนี้นาโนบอดีมีแนวโน้มที่จะเพิ่มประสิทธิภาพของ ELISA ด้วยคุณสมบัติของขนาดที่เล็กทำให้มีความเสถียรของรูปร่าง ทนต่อความร้อน และมีคุณสมบัติในการละลายน้ำที่ดีกว่า IgG ส่วนการได้มาซึ่งนาโนบอดีนั้น โดยปกติแล้วนาโนบอดีสามารถคัดแยกมาจาก immune library เนื่องจากลิมโฟไซท์ (lymphocytes) ของอูฐมีกระบวนการที่เรียกว่า โซมาติก ไฮเปอร์มิวเทชั่น (somatic hypermutation) ที่ทำให้ยีน (Genes) ของแอนติบอดีเกิดการสลับสับเปลี่ยนตำแหน่งนำไปสู่แอนติบอดีรูปแบบใหม่ที่อาจเกิดเป็นแอนติบอดีที่มีความจำเพาะและความไวสูงขึ้น กระบวนการนี้ทำให้ immune library มีประสิทธิภาพในการจับกับแอนติเจนเป้าหมายชนิดใหม่ได้ดีขึ้น แต่การที่จะได้มาซึ่ง immune library นั้นต้องทำการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของสิ่งมีชีวิตต้องใช้เวลาและงบประมาณอย่างมาก แต่ในปัจจุบันคลังนาโนบอดีแบบสังเคราะห์ขึ้นเองในรูปแบบ synthetic nanobody library นั้นเริ่มมีการผลิตและวางขายมากขึ้น โดย Synthetic nanobody library นั้นคือ immune library ที่มีการลอกเลียนแบบกระบวนการ somatic hypermutation เพื่อเพิ่มความหลากหลายของแอนติบอดีใน library เพิ่มความเป็นไปได้ที่จะได้รับแอนติบอดีที่จับกับเป้าหมายได้อย่างเจาะจงโดยไม่ต้องกระตุ้นระบบภูมิต้านทานให้เกิดขึ้นแต่อย่างใด ในการสร้าง library นี้ นาโนบอดีรูปแบบต่างๆจะถูกจัดวางบนพื้นผิวของตัวพาหะ (carriers) ทางชีวภาพเช่น เฟจ (Phage) แบคทีเรีย(bacteria) และอื่นๆ เพื่อนำไปค้นหานาโนบอดีที่ต้องการต่อไป การค้นหานาโนบอดีที่ต้องการด้วยวิธีการนี้ต้องการ library ที่มีขนาดใหญ่เพื่อให้สามารถค้นพบนาโนบอดีที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับการนำไปประยุกต์ใช้ต่อไป แต่ทว่าจำเป็นที่จะต้องใช้แรงกายของผู้วิจัยอย่างมากในการดำเนินการคัดเลือกนาโนบอดีจาก library นี้

Synthetic camelized nanobody library ที่ซื้อมานั้นอยู่ในรูปแบบสำหรับการคัดเลือกด้วยเทคนิค phage display ข้อดีหลักของเทคนิคนี้คือเป็นเทคนิคทางอินวิโทร ทำให้สามารถคัดเลือกไลบรารี่ที่มีขนาดใหญ่เท่าใดก็ได้ อย่างไรก็ดี เทคนิคนี้มีข้อเสียหลักคือมี false positive สูงมากทำให้ขั้นตอนในการทดสอบเฟ้นหาแอนติบอดีที่มีศักยภาพสูงจำเป็นทดสอบกับตัวอย่างเป็นจำนวนมากจึงมีการใช้เทคนิค Next Generation Sequencing (NGS) เข้ามาเสริม เพื่อลดจำนวนตัวอย่างที่ต้องทดสอบลง แต่ NGS ก็ยังมีข้อเสียเนื่องจากมีราคาสูง เพราะต้องใช้การวิเคราะห์ตัวอย่างลำดับดีเอ็นเอเป็นจำนวนมาก

          Twin-arginine translocation Pathway คือหนึ่งใน secretory system ที่พบในแบคทีเรีย และ plant thylakoid  เทคนิค FLI-TRAP นำเอา Tat signal sequence (บริเวณสัญญาณเปปไทด์ที่ทำหน้าที่ส่งสัญญาณให้ Tat pathway ทำการขนส่งโปรตีนที่มีสัญญาณเปปไทด์นี้อยู่จากไซโตพลาสซึมไปยังเพอริพลาสซึม)  ไปเชื่อมที่ N-terminus ของโปรตีนที่กำลังศึกษาอยู่ (scFv) และนำ reporter protein ไปเชื่อมที่ C-terminus ของแอนติเจน เมื่อแอนติเจนจับกับแอนติบอดีก็จะทำให้โปรตีนคอมเพล็กส์ถูกนำส่งออกไปยังเพอริพลาสซึมพร้อมกัน โดย reporter protein ที่เลือกใช้คือ เอนไซม์ Betalactamase หรือ Bla ซึ่งมีความพิเศษคือ เมื่อเอนไซม์นี้อยู่ในไซโตพลาสซึมจะไม่สามารถทำให้เซลล์ทนยาปฏิชีวนะจำพวกเบต้าแลคเทมริงค์ แต่เมื่ออยู่ในเพอริพลาสซึม จะทำการตัดทำลายยาปฏิชีวนะจำพวกนี้ และทำให้เซลล์สามารถเติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะอยู่ได้  จากงานวิจัยพบว่า FLI-TRAP มีศักยภาพสูง เพราะเทคนิคนี้เกิด false positive น้อย สามารถทำได้อย่างง่ายดายภายในเซลล์ ไม่ต้องเสียเวลาและค่าใช้จ่ายที่เกี่ยวข้องกับการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ สามารถนำมาใช้คัดเลือก scFv ที่มีคุณลักษณะที่ดีขึ้นกว่าที่คัดเลือกมาแล้วในรอบแรกได้โดยง่าย เพียงแค่เพิ่มความเข้มข้นของยาคาร์เบนิซิลลิน ก็ทำให้มีสภาวะที่ใช้ในการคัดเลือกที่เข้มข้นขึ้น จึงทำให้การคัดเลือกมีราคาถูก เหมาะสมในการนำมาประยุกต์ใช้กับการคัดเลือกนาโนบอดี

          ความสามารถในการผลิตนาโนบอดีที่จำเพาะกับ IFN-γ เพื่อมาใช้ทดแทนโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มีราคาแพงที่เป็นองค์ประกอบหลักของ IGRA ได้เองก็จะทำให้การตรวจวินิจฉัยมีราคาถูก จึงน่าจะเป็นประโยชน์ในการป้องกันและควบคุมโรค bTB ในปศุสัตว์ของประเทศไทย  นอกจากนี้ คุณสมบัติพิเศษต่าง ๆ ของนาโนบอดีก็ยังทำให้นาโนบอดีมีความเหมาะสมแก่การประยุกต์ใช้ในการผลิตชุดตรวจวินิจฉัยโรคกว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดีอีกด้วย เช่น นาโนบอดีมีขนาดเล็กกว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดี (15 kDa เทียบกับ 150 kDa) จึงสามารถเพิ่ม sensitivity ได้เนื่องจากมีจำนวนโมเลกุลที่ใช้ในการจับเพิ่มขึ้นต่อพื้นผิว ความสามารถในการทนความร้อนสูง ทำให้การเก็บรักษาชุดตรวจไม่จำเป็นต้องเก็บในตู้เย็นจึงเหมาะกับการใช้งานในภาคสนาม ซึ่งมีหลักการการทำงานคล้าย ๆ ชุดตรวจการตั้งครรภ์ ทำให้ง่ายต่อการใช้งานมากขึ้น ให้ผลเร็วขึ้นจากหลายชั่วโมงเป็น 10 – 20 นาที