Nanobody development for evaluation of heart failure prognosis and high blood LDL-cholesterol level treatment

แอนติบอดีเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันของสัตว์มีกระดูกสันหลัง ซึ่งในปัจจุบันนี้ได้ถูกมานำมาประยุกต์ใช้กับการแพทย์ ทั้งด้านการตรวจวินิจฉัยโรคและการรักษาโรค   แอนติบอดีชนิดที่ใช้การแพทย์นั้น มักเป็น โมโนโคลนอลแอนติบอดี (monoclonal antibody, MAbs) คือแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อเอปิโทป (epitope) เดียว  เนื่องจากเป็น homogenouse population ทำให้ลดปัญหาที่เกิดจาก cross reactivity ที่มักพบในโพลีโคลนอลแอนติบอดีได้  ถึงแม้ว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดีนั้นจะมีประโยชน์มากมาย แต่ก็มีต้นทุนในการผลิตที่สูงเนื่องจากโมโนโคลนอลส่วนใหญ่ที่มีขายในท้องตลาดในปัจจุบันนี้ใช้เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในการผลิต จึงทำให้การใช้ประโยชน์ทางด้านการแพทย์นั้นยังไม่ค่อยทั่วถึงเนื่องจากยาโมโนโคลนอลแอนติบอดีมีราคาแพงมากกว่ายาเคมีเป็นอย่างมาก  อย่างไรก็ดี เนื่องจากการรักษาโรคบางอย่างไม่จำเป็นต้องใช้คุณสมบัติบางอย่างของโมโนโคลนอลแอนติบอดี เช่น ด้านการการจับกับ Fc receptor  ที่อยู่บนผนังเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดต่างๆ ที่กระตุ้นให้เกิดปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันประเภทต่างๆ เพียงแค่คุณสมบัติที่สามารถจับอย่างจำเพาะกับ epitope ที่สำคัญบนแอนติเจนที่เป็น drug target และป้องกันการเกิด protein-protein interaction ก็เพียงพอในการยับยั้งโรค จึงทำให้มีการประยุกต์ใช้ชิ้นส่วนแอนติบอดีเป็นยารักษาโรคแทนแอนติบอดีทั้งชิ้น โดยข้อดีของการใช้ชิ้นส่วนแอนติบอดีก็คือทำให้สามารถผลิตได้ในอีโคไล ซึ่งจะทำให้ราคาการผลิตถูกกว่าการผลิตด้วยเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม  ในปัจจุบันนี้ มียาชิ้นส่วนแอนติบอดีที่ถูกผลิตในอีโคไลขายอยู่ในท้องตลาดมากถึง 5 ผลิตภัณฑ์ด้วยกัน [1]   นอกเหนือจากชิ้นส่วนแอนติบอดีที่พัฒนามาจากแอนติบอดีชนิด Immunoglobulin G (IgG) ที่ได้กล่าวมาข้างต้นแล้ว ชิ้นส่วนแอนติบอดีชนิดใหม่ที่เรียกว่านาโนบอดีก็มีการศึกษาพัฒนาเพื่อการแพทย์เป็นจำนวนมากเช่นกัน

    การค้นพบในปี ค.ศ. 1989 ได้เปิดเผยถึงแอนติบอดีชนิดใหม่เป็นครั้งแรกที่มีชื่อว่า Heavy-chain IgG ซึ่งสามารถพบได้ในซีรั่มของอูฐที่มีหนอกเดียว (dromedaries) และต่อมามีการพบเพิ่มด้วยในสายพันธุ์อื่นๆ ของตระกูล Camelidae รวมถึงในปลาฉลาม  แอนติบอดีเหล่านี้มีความพิเศษคือไม่มี light chain และไม่มี constant heavy domain ชิ้นแรก (CH1)  แต่มีเพียง heavy chain variable domain of heavy-chain antibody (VHH) และ constant heavy domain ชิ้นที่สองและสาม (CH2 และ CH3)    นาโนบอดี (Nanobody) คือ ชิ้นส่วนเฉพาะ VHH ซึ่งก็คือชิ้นส่วนแอนติบอดีที่มีองค์ประกอบเป็นเพียง monomeric variable antibody domain เพียงชิ้นเดียว ทำให้นาโนบอดีเป็นชิ้นส่วนแอนติบอดีที่มีขนาดเล็กที่สุดที่ยังสามารถจับกับแอนติเจนได้อย่างจำเพาะ    ข้อสำคัญอีกข้อหนึ่งคือ เนื่องจากนาโนบอดีมีขนาดเล็ก  นักวิจัยพบว่านาโนบอดีมีความเสถียร (stability) สูง  สามารถทนความร้อนได้ดีกว่าแอนติบอดีแบบ IgG  มีความสามารถในการละลาย (solubility) ดี  และยังสามารถถูกผลิตในแบคทีเรียได้ดีอีกด้วย  ทำให้สามารถลดต้นทุนการผลิตได้มาก

    นาโนบอดีนับว่าเป็นวิทยาการที่ค่อนข้างใหม่  งานวิจัยที่ถูกตีพิมพ์ในเร็วๆ นี้มากมายได้แสดงถึงศักยภาพของนาโนบอดีที่ถูกนำมาประยุกต์ใช้ได้ในทั้งทางด้านไบโอเทคโนโลยีและทางด้านการแพทย์ [2-4]   ปัจจุบันจึงมีหลายบริษัทที่กำลังพัฒนา synthetic nanobody library เพื่อการค้าอยู่  เนื่องจากอยู่ในรูปแบบสังเคราะห์ จึงแปลว่ามีจำนวนของนาโนบอดีอยู่มากมาย ขึ้นอยู่กับว่าเราจะใช้แอนติเจนชนิดใดเป็นโปรตีนเป้าหมายเพื่อนำมาใช้คัดเลือกนาโนบอดีที่จำเพาะกับโปรตีนเป้าหมาย ไลบรารี่นาโนบอดีสังเคราะห์นับเป็นคลังขุมทรัพย์ที่อาจมีนาโนบอดีที่จำเพาะกับแอนติเจนที่มีความสำคัญต่อการตรวจโรคอีกมากมายหลายชนิด  จึงเป็นที่น่าสนใจที่จะนำไลบรารี่เหล่านี้ เพื่อนำมาประยุกต์ใช้กับงานในหลากหลายด้าน   

    อย่างไรก็ดีการใช้ synthetic nanobody library เป็นแหล่งการหาแอนติบอดีแปลว่าเราจำเป็นต้องมีกระบวนการที่ใช้คัดเลือกนาโนบอดีที่จำเพาะกับแอนติเจนที่เป็น target ที่เราสนใจ  โดยเทคนิคที่มักใช้งานกันคือเทคนิค phage display ซึ่งเป็นเทคนิคที่ได้รับรางวัลโนเบลในปีค.ศ. 2018 [5]   Phage display เป็นหนึ่งในวิธีที่นิยมใช้ในการคัดแยก antibodies ที่มีความจำเพาะเจาะจงต่อเป้าหมายที่ต้องการ ซึ่งคุณค่าของเทคนิคนี้นั้น จะเห็นได้ชัดจากที่ครึ่งหนึ่งของรางวัลโนเบลในปี ค.ศ. 2018 ได้ถูกมอบให้กับ George P. Smith และ Sir Gregory P. Winter จากการคิดค้น phage display สำหรับการใช้คัดเลือก peptide และ antibody ซึ่ง Phage นั้นคือไวรัสที่ให้แบคทีเรียเป็น Host ในการเพิ่มจำนวน  phage display เป็นเทคนิคซึ่งอาศัยความสัมพันธ์ในการจับกันของ receptor และ ligand โดยเทคนิคนี้เป็นการโคลน ยีน receptor เข้าไปยัง phage เพื่อให้เกิดการผลิต receptor ที่ผิว  จากนั้นทําการเคลือบ ligand ที่สนใจลงใน solid support ซึ่ง phage ที่ผลิต receptor จะจับอย่างจําเพาะกับ ligand ส่งผลให้สามารถคัดเลือก phage ที่มีความสามารถในการผลิต receptor ที่มี ความจําเพาะกับ ligand ที่เราสนใจได้ กระบวนการที่ใช้ค้นหาจากวิธี Phage display นี้เรียกว่า Biopanning ซึ่งเป็นกระบวนการแบบอินวิโทร  การคัดเลือกหาความสามารถในการจับกับเป้าหมายได้อย่างแข็งแรงซ้ำๆ ทำให้ phage library อุดมไปด้วยกลุ่มที่สามารถจับกับเป้าหมายได้อย่างแข็งแรง ซึ่งข้อดีของเทคนิค phage display คือ สามารถคัดเลือก receptor ที่มีความจําเพาะกับ ligand ในจํานวนที่สูงและเสมือนว่าจะไม่มีข้อจำกัดของขนาด library ที่สามารถนำมาค้นหาด้วยวิธีนี้ได้ แต่ข้อเสียคือเทคนิคนี้เป็นเทคนิคแบบอินวิโทรทําให้ในขั้นตอนของการคัดเลือกนาโนบอดีที่ดีที่สุดยังจําเป็นต้องอาศัย การศึกษาคุณสมบัติของ individual hits จํานวนมากด้วยเทคนิคทางอินวิโทรอื่น ๆ อีก ซึ่งทําให้เสียเวลา แรงงานและทรัพยากร อย่างไรก็ตาม phage display นั่นมีข้อเสียในเรื่องของ false positive อันเป็นผลมาจาก 2 ปัจจัย 1) การจับอย่างจำเพาะกับสิ่งที่ไม่ใช้เป้าหมายที่ต้องการ และ 2) propagation advantages [6]  ในการที่เพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการนี้ จึงต้องมีการนำกระบวนการอื่นๆ อย่างเช่น เทคนิค next generation sequencing (NGS) ที่สามารถเร่งการคัดเลือกหา nanobody ที่ต้องการ และลดอัตราการเกิด False positive ลงได้ แต่ทว่ากระบวนการนี้มีค่าใช้จ่ายที่สูงมาก เนื่องจากเครื่องมือที่ต้องใช้มีราคาแพง ไม่สามารถหาได้ทั่วไป และในการทำงานต้องทำการ sequence ตัวอย่างเป็นจำนวนมากเพื่อให้ได้มาถึง consensus sequence ของแอนติบอดีที่จับได้กับโปรตีนเป้าหมาย [6]

    การเกิด False positives และการแก้ปัญหาในปัจจุบันด้วยการใช้เทคโนโลยีชั้นสูงที่มีราคาแพง เช่น เทคนิค NGS นับว่าเป็นช่องว่าง (Research gaps) ของงานวิจัยทางด้าน antibody discovery  ดังนั้น สิ่งที่งานวิจัยที่นำเสนอนี้สามารถแก้ไขปัญหานี้ได้ก็คือ การผสมผสานระหว่างเทคนิค phage display และกระบวนการคัดเลือกทางพันธุกรรมรูปแบบใหม่ Functional Ligand-binding Identification by Tat-based Recognition of Associating Proteins” (FLI-TRAP) [7] อันเป็นกระบวนการที่ประยุกต์ใช้งาน twin-arginine translocation (Tat) pathway ของแบคทีเรีย ซึ่งกระบวนการนี้ถูกพัฒนาโดย ผศ. ดร. ดุจเดือน วราโห (นักวิจัยหลักประจำโครงการศึกษาวิจัยนี้ซึ่งเป็นผู้พัฒนาเทคนิคนี้ขึ้นเองและได้รับการจดสิทธิบัตรในต่างประเทศ ซึ่งเป็นกระบวนการการคัดเลือกแบบอินวิโวซึ่งประยุกต์ใช้กลไก hitchhiker’s จาก Twin-arginine translocation (Tat) pathway ของแบคทีเรียมาต่อยอดเพื่อใช้คัดเลือกนาโนบอดีที่จำเพาะกับโปรตีนที่ต้องการ ได้แก่ 1) ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของภาวะหัวใจล้มเหลวซึ่งมีความสำคัญในการช่วยให้แพทย์ใช้ในการพยากรณ์โรค (prognosis) ซึ่งมีความจำเป็นในการใช้ในการวางแผนการรักษาผู้ป่วย 2) Pro หรือ catalytic domain ของ โปรตีนพีซีเอสเค9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; PCSK9) ซึ่งเป็นโปรตีนที่เป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญของการก่อโรคคอเลสเตอรอลสูง  โดยนาโนบอดีเหล่านี้ จะถูกคัดเลือกมาจาก synthetic nanobody library เมื่อคัดเลือกได้แล้ว จึงจะนำต้นแบบนาโนบอดีที่จำเพาะกับทั้งสองโรคมาทำการพัฒนาให้ได้คุณภาพที่ดียิ่งขึ้นด้วยวิธีการสร้างการกลายพันธุ์ด้วยเทคนิค directed evolution แล้วใช้กระบวนการ FLI-TRAP ในการคัดเลือกนาโนบอดีกลายพันธุ์ที่มีคุณสมบัติดีพอในการนำไปพัฒนาเป็นชุดตรวจวินิจฉัย หรือยาชีววัตถุเพื่อทำการรักษาโรคต่อไปในอนาคต ซึ่งความสามารถในการพัฒนานาโนบอดีเพื่อใช้ประโยชน์ทางการแพทย์ได้เองในประเทศ ไม่ว่าจะเป็นการพัฒนาเพื่อการสร้างชุดตรวจวินิจฉัยแบบอิมมูโนเซนเซอร์หรือเพื่อเป็นยาชีววัตถุก็นับว่าเป็นการตอบสนองยุทธศาสตร์ของชาติในด้านการวิจัยและสร้างนวัตกรรมเพื่อเพิ่มขีดความสามารถการแข่งขันได้ทั้งสิ้น       

    สาเหตุที่งานวิจัยชิ้นนี้มุ่งเน้นภาวะหัวใจล้มเหลวและภาวะคอเลสเตอรอลสูงเป็นเพราะทั้งสองโรคนี้เป็นภาวะที่พบบ่อย และมีแนวโน้มเพิ่มสูงขึ้นเรื่อย ๆ จึงจำเป็นต้องมีการเตรียมพร้อมในการแก้ปัญหาโรคทั้งสองนี้เพื่อเตรียมรับมือกับสังคมผู้สูงอายุที่ประเทศไทยกำลังเผชิญอยู่ ปัจจุบันมีประชากรทั่วโลกป่วยด้วยภาวะหัวใจล้มเหลว (Heart failure) ประมาณ 26 ล้านคน และมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นอีกประมาณ 46% ภายในปี พ.ศ. 2573 ซึ่งจำนวน 1 ใน 5 คน ที่มีอายุมากกว่า 40 ปี จะมีโอกาสเกิดภาวะหัวใจล้มเหลวในช่วงใดช่วงหนึ่งของชีวิต  โรคหัวใจเป็นสาเหตุการตายอันดับต้น ๆ ของประเทศไทย  ปัจจุบันการตายจากโรคหัวใจก็เพิ่มมากขึ้น  จากข้อมูลผู้ป่วยที่เข้ารักษาตัวด้วยโรคหัวใจล้มเหลวในศูนย์โรคหัวใจ โรงพยาบาลจุฬาลงกรณ์ พบว่าปี 2558 มีจำนวน 652 ราย เพิ่มขึ้นจากปี 2557 ประมาณ 45 % อันเนื่องจากการดำเนินชีวิตที่เปลี่ยนไปของคนไทย ทั้งละเลยต่อคุณภาพอาหาร การออกกำลังกาย การเผชิญกับความเครียด รวมถึงการก้าวเข้าสู่สังคมผู้สูงอายุ [8]    ภาวะหัวใจล้มเหลว (Heart Failure, HF) เป็นสภาวะขั้นสุดท้ายของโรคหัวใจและหลอดเลือด โดยมีความเสี่ยงต่อการเสียชีวิตประมาณ 35% ใน หนึ่งปีแรกหลังการวินิจฉัยและมากกว่า 50%  ของผู้ป่วยต้องเข้านอนในโรงพยาบาลอีกภายใน 6 เดือนหลังจากออกจากโรงพยาบาล [9]  การพยากรณ์โรคภาวะหัวใจล้มเหลวที่บ้านมีความสำคัญต่อการป้องกันเหตุการณ์หัวใจล้มเหลวและลดอัตราการเข้านอนโรงพยาบาล  ปัจจุบันนี้ วิธีพยากรณ์โรคภาวะหัวใจล้มเหลวส่วนใหญ่อาศัยการตรวจสอบดัชนีทางสรีรวิทยา (เช่น คลื่นไฟฟ้าหัวใจ การตรวจ X-ray อัลตราซาวนด์) และดัชนีทางชีวเคมี (เช่น electrolyte, myocardial enzyme, biomarkers ที่เฉพาะเจาะจง) แม้ว่าดัชนีทางสรีรวิทยาจะเป็นแบบไม่สร้างความเจ็บปวดให้ผู้ป่วยแต่ก็จำเป็นต้องใช้ผู้เชี่ยวชาญในการวิเคราะห์ผลทำให้ไม่สามารถนำไปใช้งานที่จุดดูแลผู้ป่วย (POC) ได้  เมื่อเปรียบเทียบแล้ว การตรวจสอบดัชนีทางชีวเคมีสามารถนำไปใช้งานที่จุดดูแลผู้ป่วยได้ง่ายกว่ามาก  การตรวจข้อมูลเกี่ยวกับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพจะทำให้ผู้ป่วยสามารถประมาณการสถานภาพของโรคของตนได้ง่ายโดยการเปรียบเทียบกับค่าอ้างอิงที่ให้ไว้    อย่างไรก็ตามจำเป็นต้องมีการตรวจสอบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพหลาย ๆ ตัวที่มีความไวสูงเพื่อเพิ่มความถูกต้องของการพยากรณ์โรคภาวะหัวใจล้มเหลว  ตัวอย่างเช่น การตรวจจับ sST2 และ BNP พร้อมๆ กัน ก็จะทำให้มีค่าทำนายที่ถูกต้องมากขึ้นสำหรับการพยากรณ์โรคภาวะหัวใจล้มเหลวมากกว่าการตรวจจับ ST2 หรือ BNP อย่างใดอย่างหนึ่ง     Suppression of tumorigenicity 2 (ST2) อยู่ในกลุ่มของ interleukin-1 receptor biomarker และเชื่อว่าความเข้มข้นของ soluble ST2 (sST2) ซึ่งเป็น ST2 ที่ละลายในเลือดที่หมุนเวียนอยู่ในร่างกาย สะท้อนถึงความเครียดของหัวใจหรือการที่หัวใจมีพังผืด (cardiac fibrosis)   ST2 จึงเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพใหม่ที่ถูกระบุไว้ใน ACCF / AHA guideline ปี 2013 สำหรับการประเมินความเสี่ยงของผู้ป่วยโรคภาวะหัวใจล้มเหลว   ในขณะที่ brain-type natriuretic peptide (BNP) เป็นฮอร์โมนที่ผลิตโดยหัวใจและถูกปล่อยออกมาเพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงความดันภายในหัวใจ การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับภาวะหัวใจล้มเหลว โดยทั่วไประดับของ BNP จะเพิ่มขึ้นเมื่อมีความผิดปกติของหัวใจเกิดขึ้นหรือเมื่ออาการแย่ลง  และมีปริมาณลดลงเมื่ออาการดีขึ้น  ส่วนใหญ่ระดับ BNP ของผู้ที่มีภาวะหัวใจล้มเหลวจะมีค่าสูงกว่าคนปกติ  ดังนั้น เมื่อนำ BNP มาประเมินร่วมกับ sST2 แล้วจึงสามารถช่วยให้การพยากรณ์โรคภาวะหัวใจล้มเหลวมีความถูกต้องมากขึ้นได้ [9] เนื่องจากโรคหัวใจวายเป็นโรคที่มีการเปลี่ยนแปลงของโรคค่อนข้างเร็วและไม่แน่นอน  ผู้ป่วยบางรายก็เสียชีวิตเฉียบพลัน บางรายก็กลายเป็นโรคเรื้อรังและมีโรคแทรกซ้อน  ดังนั้นหากในอนาคต เราสามารถนำนาโนบอดีต้นแบบที่จะได้จากงานวิจัยชิ้นนี้ไปพัฒนาต่อเป็นแพลตฟอร์มชุดตรวจวัดที่สามารถนำมาใช้ที่บ้านได้ก็จะช่วยให้ผู้ป่วยสามารถสังเกตสภาวะของโรคของตนเองได้สม่ำเสมอ  ทำให้สามารถไปพบแพทย์ได้ทันท่วงที และลดอัตราการเสียชีวิตหรือทุพพลภาพได้

          ส่วนภาวะคอเลสเตอรอลสูงนั้นเป็นภาวะที่อันตรายต่อระบบหัวใจและหลอดเลือด ซึ่งจะทำให้เสี่ยงต่อการเป็นโรคหัวใจขาดเลือด และโรคหลอดเลือดแดงแข็ง ปัจจุบันพบว่าการใช้ตัวยาทางเคมีกลุ่มของ statin ที่ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ HMG-CoA reductase ที่ใช้เปลี่ยนสารตั้งต้นในการสังเคราะห์คลอเรสเตอรอลให้กลายเป็นคลอเรสเตอรอลซึ่งสามารถลดปริมาณของคลอเรสเตอรอลได้จริงแต่ใช้ยากลุ่ม statin เป็นเวลานานพบว่าร่างกายของผู้ป่วยสามารถต่อต้านการทำงานของยาชนิดนี้ทำให้อีกทั้งยังสามารถกระตุ้นให้เกิดภาวะโรคเบาหวานอีกด้วย โปรตีนพีซีเอสเค9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; PCSK9) เป็นโปรตีนที่เป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญของการก่อโรคคอเลสเตอรอลสูง โดยกลไกที่สำคัญเกิดจาก Pro-domain และ Catalytic domain ของ PCSK9 จะเข้าจับกับ โปรตีนตัวรับที่ทำหน้าที่ย่อยสลายไขมันบนผิวเซลล์ (low density lipoprotein receptor (LDLR)) และกระตุ้นให้ LDLR เกิดการย่อยสลายทำให้กลไกในการลดระดับคอเรสเตอรอลของร่างกายทำงานได้น้อยลง โดยในปัจจุบันมีการใช้ยาในกลุ่มของโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ผลิตขายในเชิงพาณิชย์ ได้แก่ evolocumab และ alirocumab เพื่อใช้ในการรักษาภาวะคอเรสเตอรอลในเลือดสูงผ่านการยับยั้งการจับ PCSK9 และ LDLR แต่อย่างไรก็ตามการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีนั้นมีความซับซ้อนและด้วยข้อจำกัดทางการค้าทำให้ไม่สามารถผลิตตัวยาชนิดนี้ได้ในประเทศจึงต้องอาศัยการนำเข้าส่งผลให้ตัวยามีราคาแพง ทางผู้วิจัยคาดหวังว่าจะสามารถพัฒนานาโนบอดีที่มีประสิทธิภาพสูงในการจับกับ PCSK9 ในส่วน Pro-domain หรือ Catalytic-domain ของโปรตีน PCSK9 ได้ดีที่สุด และ นำไปสู่การพัฒนาแนวทางใหม่ในการพัฒนาแนวทางการรักษาภาวะคอเรสเตอรอลสูงทดแทนการใช้ยากลุ่มโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มีราคาแพงเนื่องจากต้นทุนการผลิตสูงจากการผลิตโดยใช้เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม